ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СПЕРМИЕВ В СПЕРМЕ
Скот Июнь 13th, 2010
Камеры состоят из: толстого стекла с нанесенными на нем поперечными прорезями, образующими трн поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки расположены две другие, которые на 0,1 мм выше средней. Плоскости этих площадок служат для притирания покровного стекла. Когда покровное стекло плотно притерто к предметному стеклу до появления радужных колец, на месте выгравированной сетки создается камера, закрытая с двух сторон. С других двух сторон остаются капиллярные щелевидные отверстия, через которые камеру заполняют спермойрик для смешивания спермы с раствором. При разбавлении густой или средней спермы применяют эритроцитнын меланжер. Внутри него обычно находится красная бусинка. Эритроцитный меланжер позволяет разбавлять сперму в 100 или 200 раз. На стенке имеются деления - метки: 0,5; 1,0 и 101. Второй меланжер лейкоцитный. Внутри него находится белая бусинка. Этим меланжером сперму разбавляют в 10-20 раз; его применяют для разбавления более редкой спермы (хряка, жеребца).
Разбавление спермы и умерщвление спермиев перед подсчетом производят 3%-ным раствором хлористого натрия. Для этого применяют смеситель (меланжер), предварительно промытый несколько раз дистиллированной водой, 96°-ным спиртом, эфиром и высушенный. Постоянной резиновую трубку, лаборант насасывает необходимое количество спермы, обтирает кончик смесителя мягкой чистой салфеткой, а затем набирает в иего 3%-ный раствор хлористого натрия, который умерщвляет спермиев и разбавляет сперму, что облегчает подсчет.
Затем оба конца смесителя зажимают пальцами (большим и указательным правой руки) и в течение 2-3 мин переворачивают его вверх и вниз (встряхивают). Находящаяся в смесителе сперма смешивается с раствором хлористого натрия. После этого из смесителя выпускают четыре-пять капель жидкости, чтобы удалить из тонкой части трубки (капилляра) не смешанный со спермой раствор. Кончик смесителя обтирают чистой салфеткой и наносят каплю спермы на среднюю пластинку камеры (рис. 38). По щелевидным капиллярным отверстиям сперма проникает под покровное стекло и заполняет сетку. При этом на сетке камеры не должно быть воздушных пузырей, так как это мешает точности подсчета.
Подсчет спермиев. Концентрация спермнев выражается числом их в 1 мм3 спермы в миллионах или в 1 мл спермы в миллиардах и обозначается буквой С. Для определения концентрации спермиев заполненную спермой счетную камеру осторожно переносят на предметный столик микроскопа, который должен иметь горизонтальное положение. При слабом увеличении на стекле находят сетку. Спермии подсчитывают при таком увеличении (в 400-600 раз), чтобы в поле микроскопа помещался один большой квадрат. В счетной камере Тома спермии подсчитывают в четырех больших квадратах, расположенных по диагонали сетки, и в одном квадрате в углу. В камерах Горяева и Клю-чарева-Иредтеченского спермии подсчитывают в пяти больших квадратах,
расположенных по диагонали сетки, считая в каждом квадрате 16 малых квадратиков. Таким образом подсчитывают спермин, находящиеся в 80 малых квадратиках.
При пользовании счетной камерой с сеткой Бюркера число спермиев подсчитывают в 80 малых квадратах, начиная сверху. Один малый квадрат в правом нижнем углу не считают.
В каждом маленьком квадратике подсчитывают тех спермиев, головки которых лежат в данном квадратике, и тех, которые размещены на верхней и левой линиях квадрата. Спермиев, расположенных на нижней и правой линиях, в число спермиев данного квадратика не включают (рис. 39).
Число спермиев каждого квадратика записывают, а затем складывают. Для подсчета удобно пользоваться счетчиками для форменных элементов крови.
Затем производят пересчет числа спермиев в 1 мм3. Так как площадь каждого маленького квадратика составляет 1/400 мм2, то для перевода на 1 мм2 следует подсчитанное в 80 малых квадратиках число спермиев умножить иа 5, а для перевода на 1 мм3 - еще на 10 (так как глубина камеры 0,1 мм) и, наконец, на степень разбавления. Для определения числа спермиев в 1 мл (1 см3) число их в 1 мм3 умножают на 1000.
Расчет числа спермиев производят по формуле:
400-п-Д ~ N-p-1000000 ‘
где п - число подсчитанных спермиев; Д - степень разбавления; N - число сосчитанных малых квадратов (80); р - глубина камеры (мм).
Множитель 400 введен в формулу потому, что площадь малого квадратика равна 1/400 мм2. Следовательно, для перевода на 1 мм2 необходимо подсчитанное число спермиев умножить на 400. Полученная в формуле величина С (концентрация сиермиев) разделена на 1 000 000, поэтому получается содержание спермиев в миллионах на 1 мкл (мм3), или, что то же, в миллиардах на 1 мл (см3).
Чтобы получить более точные данные, при определении концентрации спермиев рекомендуют повторить смешение и подсчет спермиев произвести дважды. Расхождение результатов должно быть в пределах ие более 10%. Если оно больше 10%, то производят подсчет в третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%.
Для определения концентрации спермиев в сперме жеребца во Всесоюзном научно-исследовательском институте коневодства разработаны стандарты. Стандарты представляют собой шесть запаянных пробирок, в которые налита жидкость, имитирующая сперму жеребца. В каждой пробирке жидкость по мутности соответствует сперме с концентрацией в 10, 50, 100, 200, 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл. К стандартам приложены две пустые пробирки такого же диаметра, как и пробирки с жидкостью.
Определение концентрации спермиев по стандартам производится следующим образом: в пустую пробирку наливают сперму и просматривают на свет, сравнивая со стандартными пробирками. Подбирают стандарт, наиболее близкий по мутности к определяемой сперме, и указанную на пробирке концентрацию принимают за концентрацию исследуемой спермы. Может быть и промежуточная концентрация, например 75 млн. (мутнее 50, но прозрачнее 100).
Если сперма густая и концентрация спермиев больше 500 млн. в 1 мл, то ее можно разбавлять глюкозной средой в 2 раза и затем определить ее концентрацию по стандартам, умножив на 2 полученный результат.
К комплекту стандартов приложена стеклянная палочка, которую прикладывают к обратной стороне просматриваемых пробирок. По степени видимости палочки удобнее установить сравнительную степень мутности спермы и стандартов.
Тэги:сперма